Новости Научного подразделения

06.09.2017
Ученые из Института биоинформатики и СПбГУ успешно применили секвенатор MinION компании Oxford Nanopore, расшифровав с его помощью последовательность генома пресноводной мшанки Cristatella mucedo
Как мы запускали MinION. Часть 1

Сегодня мы начинаем рассказ про технологию секвенирования, основанную на применении нанопор, и планируем осветить как теоретические основы, так и особенности ее практического применения в типичной российской лаборатории. А все потому, что совсем недавно ученые из Института биоинформатики и СПбГУ – впервые в Петербурге, и, насколько нам известно, в России – успешно применили секвенатор MinION компании Oxford Nanopore, расшифровав с его помощью последовательность генома пресноводной мшанки Cristatella mucedo, и осуществили его сборку.

Мы уже не раз писали про применения MinION, например, как его использовали для секвенирования полноразмерных РНК или для получения данных метилирования генома. Теперь мы решили подробно рассказать, что происходит, когда у вас есть конкретная задача — геном, который нужно прочитать, и желание сделать это при помощи секвенатора нового поколения MinION. В первой части — о том, чем же так хороша технология компании Oxford Nanopore и что сделало ее в последние годы еще лучше. Будущее уже добралось до нас, и мы расскажем о нем в нескольких частях!

Высокоэффективным секвенированием третьего поколения (3rd generation) называют технологии, в которых, в отличие от известных ранее методов (2nd generation, NGS), получаются прочтения большой длины. На данный момент большая часть секвенирования осуществляется при помощи технологии Illumina, которая позволяет получить огромное количество коротких (до 300 п.н.) прочтений. Экспериментаторы уже более 10 лет заслуженно высоко оценивают эту платформу, отличающуюся крайне низким процентом ошибок (около 0.1%), и наилучшей ценой за 1Gb сиквенсов. Секвенаторы IonTorrent, популярные в странах Восточной Европы, позволяют получать прочтения до 400 п.н., дают процент ошибок около 1%; в число их достоинств включают высокую скорость секвенирования, а также относительную дешевизну приборов.

Секвенирование третьего поколения сегодня представлено двумя лидирующими компаниями — Pacific Biosciences (часто называемая PacBio) и Oxford Nanopore. Козырь секвенирования третьего поколения — очень длинные прочтения, достигающие размера в тысячи пар оснований, что помогает решить целую кучу проблем, в которых короткие риды бессильны, таких, как расположение экзонов в длинных генах при альтернативном сплайсинге, идентификация крупных вставок, делеций, и других геномных перестроек. Особенно значительным является преимущество секвенаторов третьего поколения в задачах сборки сложных геномов — проблемы, являющиеся теоретически нерешаемыми для коротких прочтений, с легкостью решаются длинными. Главным примером такой проблемы является сборка разнообразных повторных последовательностей, вплоть до центромеров.

Технология PacBio для одномолекулярного секвенирования использует полимеразу, которая достраивает к читаемой последовательности по 1 нуклеотиду за шаг, то есть секвенирование все еще осуществляется за счет синтеза комплементарной цепи ДНК, как и во многих технологиях NGS. Как и в случае с любой полимеразой, это ограничивает среднюю длину прочтения примерно 10,000 п.н. — после этой длины полимераза просто перестает работать. Действительно, даже простая ПЦР-амплификация фрагмента такой длины — крайне непростое дело, и требует специальных дорогих ферментов. Другим недостатком PacBio является необходимость больших разовых инвестиций — прибор стоит ненамного дешевле недавнего флагмана Illumina HiSeq, то есть около миллиона долларов.

Компания Oxford Nanopore появилась на рынке несколько лет назад и мгновенно наделала много шума, пообещав выпустить портативный секвенатор размером с флешку за 1000 долларов. Можно представить, какие перспективы открывала бы такая технология — невероятно мобильный, да еще и дешевый прибор — единственный, который реально взять с собой в полевые исследования. И действительно, MinION за годы существования уже поработал в Антарктиде, Западной Африке и Бразилии, изучая генетические варианты вирусов Эболы и Зика (и сильно помог в борьбе с распространением эпидемии!), а в 2016 году слетал на Международную космическую станцию, чем не способен похвастаться никакой другой секвенатор.

Какой же принцип секвенирования сделал маленький приборчик MinION таким непохожим на все остальные? Представьте себе маленькую белковую пору с диаметром отверстия примерно в ширину одноцепочечной ДНК — около нанометра (10 ангстрем). Именно через такую пору протягивается молекула ДНК, а сенсор, окружающий пору — своеобразный наноамперметр — способен уловить мельчайшие изменения плотности тока, которые вызваны тем, что четыре нуклеотида — A, C, G, T — имеют заметно отличающийся размер. К поре прикреплены белки, расплетающие ДНК (хеликазы), а также «моторные», АТФ-зависимые молекулы, толкающие цепь ДНК в пору (описать точный состав и принцип действия не представляется возможным из-за коммерческого статуса технологии). За секунду современная пора R9.4 «считывает» около 450 оснований, а секвенирование не останавливается, пока вся молекула ДНК целиком не будет протянута через пору. В каждый момент времени в поре скрывается примерно 5 нуклеотидов, поэтому в компании ведутся постоянные попытки сделать пору настолько узкой, чтобы в нее помещался только один нуклеотид — это повысит точность чтения. На выходе получается график (смотрите картинку 1), отражающий скачки плотности электрического тока на сенсоре, каждому нуклеотиду соответствует своя величина тока на кривой, официально называемой «закорючкой» (squiggle). Процесс перевода сырого сигнала (raw signal) в нуклеотидную последовательность называется определением оснований — basecalling. На самом деле, конечно, basecalling производится во всех известных секвенаторах, ни один из которых не выдает результат сразу в виде последовательности букв.

Ранее компания использовала пору R7 из E.coli, что вызывало сложности и тормозило технологию. Во-первых, пора не отличалась безумной производительностью. Во-вторых, Oxford Nanopore был вовлечен в юридические тяжбы против коммерческого гиганта Illumina по поводу патента на пору. Все изменилось в октябре 2016 года, когда компания представила новую, «дизайнерскую» пору R9, убивающую сразу двух зайцев. По поводу нее не может быть заведена судебная тяжба, так как пора уж точно является разработкой самой компании; помимо этого, эта версия «химии» сильно выигрывает в производительности: за один запуск стало возможным собрать до 10 миллиардов пар оснований данных.

В следующей части мы расскажем про принципиально важную характеристику, из-за которой MinION сначала невзлюбили — процент ошибок при секвенировании, а также о том, во сколько обходится работа такого прибора.

Картинка: принцип работы поры и сигнал, получающийся на выходе (из видеоролика Oxford Nanopore.

Автор: Марина Слащева